Untersuchung der Aggregation von Biomakromolekülen mit OF2i®-SLS und SEC
Um die medizinische Forschung voranzutreiben, beispielsweise im Zusammenhang mit Arteriosklerose, möchten Forscher die genaue Struktur und Zusammensetzung von LDL-Molekülen kennenlernen und besser verstehen, wie und wann diese aggregieren.
Herausforderung
In einer Machbarkeitsstudie mit der Medizinischen Universität Graz haben Forscher um Dr. Karin Kornmüller OF2i® mit SEC (Größenausschluss-Chromatographie) gekoppelt, um das dynamische Aggregationsverhalten von LDL-Molekülen (Low-Density-Lipoprotein) zu untersuchen. Es gibt eine Reihe von Methoden, um Informationen über Nanoaggregate wie LDL zu erhalten, z. B. SEC, (Kryo-)EM, Gelelektrophorese, SAXS, spektroskopische Techniken (CD, IR, Fluoreszenz) oder kalorimetrische Techniken (DSC).
Eckpunkte
Das OF2i®-Gerät mit seiner statischen Lichtstreuungsfunktion (SLS) (BRAVE B-Aware-Modul) hat das SLS-Signal sowie die Partikelkonzentration in den Fraktionen, die die SEC-Säule passiert haben, kontinuierlich gemessen. Der erste Schritt bestand darin, eine mögliche Korrelation zwischen den SEC-UV-280-nm-Peaks, den mit OF2i® gemessenen Peaks der Partikelkonzentration und den entsprechenden Signalen des SLS-Moduls BRAVE B-Aware zu ermitteln. Das Ziel war es, Partikelaggregationsfraktionen zu entdecken, die möglicherweise nicht allein über die UV-Signale nachweisbar sind.
Eine hohe statische Lichtstreuungsintensität korreliert gut mit monodispersem LDL (Zeitspanne t2 bis t3 in Abbildung 1). Diese Fraktion stellt die reinste LDL-Probe mit der geringsten Wahrscheinlichkeit für Aggregationen dar. Hier hilft die unübertroffene Empfindlichkeit von OF2i®-SLS bei der Auswahl der reinsten Fraktionen (d. h. ohne nachweisbare Aggregate) – Proben, die sich am besten für Kryo-EM-Untersuchungen auf High-End-Geräten eignen, um die atomare Struktur des Biomakromoleküls zu ermitteln.
Abbildung 1(a) zeigt die Fraktionen, wie sie vom UV-280-Detektor innerhalb der SEC-Anordnung aufgezeichnet wurden.
Abbildung 1(b) stellt die statische Lichtstreuung dar, die mit dem OF2i®-Detektor B-Aware-Modul aufgezeichnet wurde. Die Überlagerung hilft bei der Auswahl der reinsten Fraktionen nicht aggregierter Fraktionen für weitere Kryo-EM-Untersuchungen.
LDL-Partikel haben einen Durchmesser von ca. 22 nm, daher wird monodisperses LDL mithilfe des statischen Lichtstreuungssignals von OF2i® überwacht, wie in Abbildung 1 beschrieben. Sobald jedoch Aggregate vorhanden sind (mit einer Größe von mehr als 50 nm bis 100 nm, was Clustern von nur wenigen LDL-Partikeln entspricht), können diese mit OF2i® mit Einzelpartikelgenauigkeit überwacht werden. Der Peak der Partikelverteilungen bei t1 in Abbildung 2(b) korreliert mit dem vom UV-Detektor bei t1 in Abbildung 2(a) erfassten Peak. Das Vorhandensein von Aggregaten in dieser Fraktion wurde durch Gelelektrophorese und TEM-Bildgebung bestätigt. Diese Fraktion ist von großem Interesse, da sie weiter untersucht wird, um mehr darüber zu erfahren, wie sich aggregiertes LDL von nicht aggregiertem LDL unterscheidet und welche Auswirkungen dies auf die Gesundheit hat.
Abbildung 2(a) zeigt die vom UV-280-Detektor innerhalb der SEC- Installation aufgezeichneten Fraktionen im Vergleich zu der von OF2i® nachgewiesenen Konzentration von Aggregaten (Abbildung 2(b)). Die Schulter zum Zeitpunkt t2 steht für eine sehr geringe Konzentration an Aggregaten, was auch durch die Ergebnisse der Gelelektrophorese und der TEM bestätigt wird.
Es ist interessant, zusätzliche Peaks im 120-min-SEC-Bereich zu sehen, die vom UV-Detektor nicht erfasst wurden. Weitere Untersuchungen sind hier erforderlich.
Benefits & Ausblick
Die leistungsstarke Kombination aus kontinuierlicher OF2i®-Partikelcharakterisierung und ergänzenden Daten aus der statischen Lichtstreuung (SLS) liefern Einblicke in das Aggregationsverhalten auf einer völlig neuen Ebene. Diese innovative Synergie bietet eine Reihe überzeugender Vorteile für die Echtzeit-Überwachung von Aggregationen:
Gleichzeitige Ergebnisse mit SEC: Analyse der Probe parallel zu SEC-Workflows für eine nahtlose Integration und höhere Effizienz.
Hochauflösende Partikelidentifizierung: Klar unterscheiden zwischen nicht aggregierten und aggregierten Fraktionen auf Einzelpartikelebene, um sicherzustellen, dass nur die reinsten Proben für hochwertige Anwendungen wie Kryo-EM ausgewählt werden.
Keine zusätzliche Probenvorbereitung: Die Messungen werden direkt im Durchfluss durchgeführt, wodurch unnötige Schritte entfallen und wertvolle Zeit gespart wird.
Echtzeit-Reaktionsüberwachung: Molekulare Wechselwirkungen verfolgen, während sie in der Durchflusszelle stattfinden, um so die Reinheit der Probe dynamisch und zuverlässig bewerten zu können.
Die Kombination von OF2i® und SLS mit BRAVE B-Curious und dem Softwaremodul BRAVE B-Aware bietet eine intelligentere, schnellere und präzisere Möglichkeit, die Aggregation zu überwachen und die Integrität der Probe sicherzustellen.
Konfiguration:
BRAVE B-Curious mit BRAVE B-Aware Software-Modul für Partikelgrößenbestimmung, Fluid-Automatisierungsmodul, Kontroll- und Evaluierungsmodule & Software
Der in diesem Fall verwendete Analyseaufbau
Der BRAVE B-Curious Partikelanalyzer mit BRAVE B-Aware Softwaremodul.
Das BRAVE B-Aware Modul erkennt und verfolgt sehr kleine Partikel (ab 5 nm) und liefert Partikelanzahlen und Partikelkonzentrationswerte.
Ideal für die Erkennung des Beginns von Aggregationen und die Verfolgung des Probenverhaltens, wenn sehr kleine Partikel beteiligt sind.
Kontinuierliche Durchflussmessung.
